ISOLATION, IDENTIFICATION AND PATHOGENICITY ANALYSIS OF BACILLUS CEREUS FROM CHINESE SOFT-SHELLED TURTLES, PELODISCUS SINENSIS
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摘要: 2016年夏杭州某中华鳖(Pelodiscus sinensis)养殖场出现大量发病, 病鳖呈厌食、反应迟钝、四肢无力、池边独游、濒死前不停摇头等病症, 死亡率20%以上。用营养琼脂从典型症状濒死中华鳖分离到革兰阳性短杆状, 芽孢近中生或中生的分菌株; API 50 CHB对分离菌株T91-1鉴定结果显示与蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)参考菌株ATCC 14579 97.4%相似; T91-116S rDNA和gyrB基因序列与ATCC 14579相似度为99%, 确认T91-1为蜡样芽孢杆菌。T91-1在羊血平板呈典型β溶血, 牛奶平板上出现明显透明圈, 表明存在溶血性和胞外蛋白酶类毒素。用T91-1肌肉注射感染健康中华鳖LD50为4.91×105CFU/ind., 死亡鳖出现与自然发病鳖类似症状; 感染发病中华鳖血和肝印/涂片瑞氏-姬姆萨染色可见组织间隙有大量芽孢杆菌。自然发病鳖肾、肝、肺、心病理切片可见大量芽孢杆菌, 病鳖血管扩张充血, 嗜酸性粒细胞浸润。T91-1灌胃ICR乳鼠3d后可全部死亡, 死亡鼠呈皮下出血等症状; T91-1腹腔注射和灌胃ICR 4周龄小鼠12—24h可出现迟钝、厌食等症状, 1周内未出现死亡。上述结果表明蜡样芽孢杆菌对中华鳖有很强毒力, 对小鼠有较强肠毒性, 是引起本次杭州中华鳖暴发性疾病的病原。Abstract: The epizootic outbreaks were recorded in Chinese soft-shelled turtle farm in Hangzhou, Zhejiang province in summer of 2016. The diseased turtles were an orexia, lags in responsive, abnormal or lonely swimming. The moribund turtles would creep and lie on the shore with continuous head-shaking with a 20% mortality. Gram positive rod with single endospore were isolated from liver, kidney, spleen and blood of moribund turtles with typical symptoms. Stain T91-1 was identified as Bacillus cereus with API 50 CHB strip, 97.4% similarity to B. cereus reference strains by BioMérieux APIWEB Plus software V3.2.2. The identification was confirmed by phylogenetic analysis using 16S rDNA and gyrB whole gene, 99% similarity to type strains ATCC14579 of B. cereus T91-1 that showed typical β-hemolytisis on sheep blood agar and large transparent circle on the milk agar, indicating the existence of hemolytic and extracellular protease toxin. The T91-1 challenged turtles died from day 3 to day 7 with the symptoms similar to natural infected turtles, and LD50 of B. cereus T91-1 was 4.91×105 CFU/ind. Large number of Bacillus-like rods were observed in blood and liver smear stained with Wright-Giemsa. A large number of Bacillus-like were found in kidney, liver, lung and heart of native diseased turtles with vascular dilatation and congestion, as well as infiltrated eosinophils. All ICR suckling mice were killed at day 3 after oral administrated with T91-1 at concentration ranged from 1.2×106 CFU/mL to 1.2×108 CFU/mL with hemorrhagic subcutis and cerebrum. Four weeks old mice were injected or oral administrated with T91-1 at 1×107—109 CFU/mL, which showed anorexia, lags in responsive within 12h to 24h, but no death was recorded. These results demonstrated that B. cereus T91-1, with the strong pathogenicity to Chinese soft-shelled turtles and enterotoxigenic to mice, could be the pathogen of outbreaks of Chinese soft-shelled turtles diseases in this farm in Hangzhou.
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Keywords:
- Chinese soft-shelled turtle /
- Bacillus cereus /
- Identification /
- Pathogenicity
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浮游动物作为次级生产者, 是水域食物网中的重要一环, 其种类和数量的变动会直接或间接的影响着水体中其他水生生物的分布[1]。由于浮游动物对水环境变化的敏感性和适应性差异, 利用浮游动物群落结构的变化来检测和评价水环境具有重要的应用价值, 弥补水体理化指标在水质评价上的不足[2]。近年来相关研究显示, 利用浮游动物多样性指数可以反映水体的富营养化状况和水质受污染程度[3—6]。同时, 由于我国水体污染状况严峻, 各大湖泊、流域、水库等也均积极开展相关的生态学调查, 利用浮游动物群落结构变化及多样性指数对水质进行评价[7, 8]。
沙颍河是淮河流域最大的一条支流, 西起河南省伏牛山, 跨豫、皖两省, 流经郑州、平顶山、漯河、周口、阜阳等市, 东至安徽省颍上县沫河口入淮。全长约620 km, 流域面积39880 km2, 接近淮河流域总面积的1/7, 其中周口以上为沙颍河的上游部分, 长324 km, 流域面积为25880 km2; 周口到阜阳市是沙颍河的中游部分, 河长172 km; 阜阳市以下为下游部分, 河长124 km[9]。自1989年以来, 淮河干流共发生5次较大污染, 都与沙颍河有关[10]。尤其, 沙颍河流域中的贾鲁河中牟段主要承担着郑州市工业废水和城市生活污水排泄, 排放量逐年增长, 河道及地下水均受到不同程度的污染, 河流断面水质超过Ⅴ类水标准, 由于水体严重污染、生态环境水量不足, 造成生态环境恶化, 水生植物、鱼类、底栖生物、微生物、湿地等大多消亡, 既丧失了水体的自净能力, 也破坏了河道滨水景观环境[11]。
目前, 关于沙颍河流域的调查研究包括沙颍河河南段水质理化指标的时空变化[12, 13]、浮游甲壳动物时空变化[14]、沙颍河流域着生藻和大型底栖无脊椎动物[15]等的研究, 缺乏对整个沙颍河流域浮游动物的系统调查研究。本次研究以沙颍河流域主要支流贾鲁河和其干流沙颍河为研究主体, 调查沙颍河流域浮游动物群落结构的空间变化, 并利用浮游动物评价水质污染状况。本研究可为沙颍河流域水环境治理、水体生态环境持续健康发展和淮河流域水环境治理等提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 采样时间与采样点设置
2016年秋季对沙颍河流域浮游动物进行调查研究, 共设置20个采样点。其中, 9月中旬采样点为14个, 10月初又补充采样点6个。在每个采样点均有重复样。具体采样位置如图 1, 详细信息见表 1。所有采样点均经GPS定位。
1.2 浮游动物样品的采集与鉴定
浮游动物定性样品: 以25号筛绢制成的浮游生物网(孔径64 μm)在表层水面以下呈“∞”字形捞取3—5min, 并将滤取的样本放入标本瓶中, 加4%的福尔马林溶液固定。
浮游动物定量样品: 用2.5 L的有机玻璃采水器(水生所制)取表层和底层的水样混合, 再从混合样中取10 L和1 L分别用于大型浮游甲壳类和轮虫的定量。10 L样先用孔径64 μm的浮游生物网过滤, 收集于50 mL的塑料瓶中并用4%的福尔马林溶液保存; 1 L样加Lugol氏液固定后带回实验室沉降, 自然沉降48h后, 用虹吸管除去上清液收集沉积物再浓缩成50 mL并保存。
参照分类资料[16—22]的描述, 在OLYMPUS BX53显微镜和解剖镜下进行浮游动物鉴定和计数。
表 1 沙颍河流域各采样位点详细情况Table 1. Distributions of sampling sites in the Shaying River Basin样品编号
Sample number采样地点
Sampling site位置(经度, 纬度)
Location (longitude and latitude)样点类型
Sites type河流名称
River name1 郑州市惠济区祥云寺 E113°43′45.71″, N34°52′6.74″ 河道 贾鲁河 2 郑州市中牟县白沙镇 E113°52′′37.28″, N34°46′31.49″ 河道 贾鲁河 3 郑州市中牟县明山庙村 E114°0′12.92″, N34°45′41.91″ 河道 贾鲁河 4 郑州市中牟县陈桥村 E114°06′32.26″, N34°40′54.28″ 河道 贾鲁河 5 扶沟县摆渡口村 E114°20′11.85″, N34°9′21.44″ 河道 贾鲁河 6 新密市大槐镇铁匠沟村 E113°29′23.62″, N34°26′16.06″ 河道 双洎河 7 新密市大槐镇桃园村 E113°31′29.48″, N34°26′8.57″ 河道 双洎河 8 新密市新寨遗址 E113°32′54.25″, N34°26′12.45″ 河道 双洎河 9 扶沟县双洎河桥头 E114°18′49.24″, N34°9′39.26″ 河道 双洎河 10 周口市商水县邓城镇 E114°36′28.49″, N33°37′52.36″ 河道 沙河 11 西华县徐桥村徐桥 E114°29′51.65″, N33°42′12.21″ 河道 颍河 12 周口市西沙河大桥 E114°18′48.81″, N34°9′40.18″ 河道 沙颍河汇合 13 周口市李埠乡村牛滩村 E114°43′45.88″, N33°35′12.93″ 河道 沙颍河 14 周口项城市郑埠航运枢纽 E114°52′12.72″, N33°30′35.32″ 河道 沙颍河 15 周口市沈丘县纸店镇沙河大桥 E114°52′0.91″, N33°30′37.00″ 河道 沙颍河 16 阜阳市沙颍河国家湿地公园 E115°16′35.19″, N33°18′9.00″ 河道 沙颍河 17 阜阳市袁集镇沙颍河特大桥 E115°54′52.60″, N33°50′25.57″ 河道 沙颍河 18 阜阳市颍上县老沫口子 E115°54′53.14″, N33°50′27.10″ 河道 沙颍河 19 阜阳市颍上县老沫口子 E115°54′54.10″, N33°50′27.10″ 河道 淮河(干流) 20 阜阳市颍上县老沫口子 E115°54′54.42″, N33°50′27.64″ 河道 淮河(干流) 1.3 数据分析
运用优势度Y计数出优势物种, 计算公式为: Y=(Ni/N) fi, 式中Ni为第i种的个体数, N为样品中所有种类的个体数, fi为第i种的出现频率, Y>0.02为优势种。
$H' = - \sum {\left( {\frac{{{n_i}}}{N}} \right)} \left( {{{\log }_2}\frac{{{n_i}}}{N}} \right)\;\;J' = \frac{{H'}}{{{{\log }_2}S}}$
运用Shannon-Wiener指数(H′)[23]来表示浮游动物群落的多样性, 式中, N为浮游动物总个体数, ni为第i种的个体数。同时, 运用Pielou指数(J′)[24]表示物种均匀度, 式中, S为物种总数。
2. 结果
2.1 浮游动物的种类组成
通过对20个采样点的采样及检测分析, 发现共有浮游动物36属78种, 其中, 轮虫20属60种, 占浮游动物总物种数的76.92%; 枝角类10属12种, 占浮游动物总物种数的15.38%; 桡足类6属6种, 占浮游动物总物种数的7.69%。总体上而言, 沙颍河流域浮游动物物种类型以轮虫为主。各采样点具体物种数详见图 2, 可以明显看出贾鲁河浮游动物种类数较多, 双洎河浮游动物种类数相对较低, 且沿着沙颍河支流汇入淮河干流的过程中, 浮游动物的种类数呈现先增加后逐渐降低的趋势。
2.2 浮游动物的优势种
如表 2所示, 由于桡足类各采样点优势种主要为桡足类无节幼体和桡足类幼体, 因此文中未计算其优势度, 仅计算轮虫、枝角类的优势度, 结果表明: 沙颍河流域轮虫主要优势种为9种, 枝角类主要优势种为4种。各个采样位点浮游动物的优势种为1至7种。其中, 沙颍河流域上游贾鲁河浮游动物的优势种为长肢多肢轮虫、裂痕龟纹轮虫、角突臂尾轮虫、萼花臂尾轮虫、微型裸腹溞、象鼻溞、圆形盘肠溞; 双洎河优势种为长肢多肢轮虫、罗氏异尾轮虫、角突臂尾轮虫、萼花臂尾轮虫、狭甲轮虫、微型裸腹溞、象鼻溞、圆形盘长溞, 上游浮游动物优势种多为喜富营养化条件下的浮游动物。沙颍河流域中下游浮游动物优势种为长肢多肢轮虫、裂痕龟纹轮虫、角突臂尾轮虫、曲腿龟甲轮虫、无柄轮虫、奇异六腕轮虫、微型裸腹溞、象鼻溞。
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图 2 沙颍河流域各采样点浮游动物各类群物种数Figure 2. The abundance of each species of zooplankton in different sampling sites in the Shaying River Basin2.3 浮游动物的密度与生物量
各采样点浮游动物密度为125—13701 ind./L（图 3） 。轮虫在4号采样点的密度最高为13650 ind./L, 以长肢多肢轮虫、角突臂尾轮虫、萼花臂尾轮虫、三肢轮虫等为主要组成部分, 其他采样点轮虫的密度为125—7889 ind./L, 以长肢多肢轮虫和裂痕龟纹轮虫为主要组成; 枝角类在12号采样点的密度最高为380 ind./L, 以微型裸腹溞和短尾秀体溞为主要组成部分; 桡足类在12号采样点的密度最高为817 ind./L, 主要以桡足类幼体为主要组成部分; 无节幼体在9号采样点密度最高, 为1550 ind./L。
从生物量(图 4)上而言, 浮游动物的总生物量范围为0.15—9.32 mg/L。轮虫在4号采样点的生物量最高为9.16 mg/L; 枝角类和桡足类在12号采样点的生物量最高, 分别为3.68和2.64 mg/L; 无节幼体在9号采样点的生物量最高, 为4.65 mg/L。
2.4 浮游动物多样性指数和均匀度指数
检测位点中的Shannon-Wiener多样性指数H′为1.03—3.51, Pielou指数J′的变化范围为0.26— 0.70(图 5)。当H′大于3.0时表示水体轻污染或无污染, 1.0<H′<3.0时表示水体中污染,H′<1.0表示水体重污染。同时, 当0.5<J′<0.8表示水质轻污染或无污染, 0.3<J′<0.5表示水质中污染,J′<0.3表示水质重污染。参照评价标准[25]对检测位点的水质进行评价: 沙颍河流域各采样位点的水质, 除了4号、5号、15号、17号表现出轻污染或无污染, 其他采样位点水质均为中污染或重污染。
表 2 沙颍河流域浮游动物优势种空间变化及其优势度Table 2. Spatial variations of dominant species and dominance of zooplankton in the Shaying River Basin种名Species 拉丁名Latin name 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 长肢多肢轮虫 Polyarthra
dolichoptera0.35 0.54 0.22 0.20 0.21 0.22 0.66 0.12 0.43 0.43 0.51 0.21 0.12 0.39 0.37 0.43 裂痕龟纹轮虫 Anuraeopsis fissa 0.05 0.03 0.11 0.05 0.04 0.17 0.14 0.26 0.04 0.03 0.09 罗氏异尾轮虫 Trichocerca rousseleti 0.07 0.13 0.11 角突臂尾轮虫 Brachionus angularis 0.05 0.04 0.05 0.03 0.04 0.13 萼花臂尾轮虫 B. calyciflorus 0.02 0.03 0.06 0.03 0.11 曲腿龟甲轮虫 KeratelIa valga 0.09 0.03 0.02 0.20 0.03 0.21 0.18 0.16 一种狭甲轮虫 Colurella sp. 0.25 0.25 一种无柄轮虫 Ascomopha sp. 0.14 奇异六腕轮虫 Hexarthra mira 0.12 0.20 0.02 微型裸腹溞 Moina micrura 0.69 0.27 0.03 0.19 0.23 象鼻溞 Bosmina sp. 0.03 0.10 0.62 0.50 0.69 0.92 0.02 0.90 0.92 0.51 0.92 0.67 0.89 0.62 0.68 短尾秀体溞 Diaphanosoma
brachyurum0.18 圆形盘肠溞 Chydorus sphaericus 0.56 0.52 0.67 0.17 ![]()
图 5 沙颍河流域各采样点浮游动物的生物多样性指数和物种均匀度指数Figure 5. Shannon-Wiener index and Pielou evenness index of zooplankton in different sites in the Shaying River表 3 淮河流域浮游动物群落结构的时间变化Table 3. Temporal variations of zooplankton community structure in the Huaihe River Basin时间
Date地点
Station原生动物
Protozoa轮虫
Rotifera枝角类
Cladocera桡足类
Copepoda备注
Remarks1982年5月 淮河干流
蚌埠闸[31]765 ind./L
0.02 mg/L30 ind./L
0.06 mg/L57 ind./L
1.14 mg/L35 ind./L
1.05 mg/L1982年蚌埠闸上水体中耐污
能力弱的桡足和枝角类的数
量分别为35 ind./L和57 ind./L2005年3月—
2005年5月淮河蚌
埠段[32]N N 2属3种 5属5种 浮游甲壳动物密度为1.75—
67.51 ind./L, 水体为重污染,
水质很差2006年5月 淮河干流
蚌埠闸[31]10 ind./L
0.0005 mg/L9 ind./L
0.001 mg/L0.10 ind./L
0.001 mg/L0.02 ind./L
0.004 mg/L2006年耐污能力弱的桡足和枝
角类的这两类种群数量分别为
0.10 ind./L和0.02 ind./L2007年1月—
2007年12月淮河中
游[33]N N 8属13种 9属11种 浮游甲壳动物密度季节变动范
围为7.9—58.0 ind./L, 年均值为
13.2 ind./L2011年3月—
2011年12月淮河干
流[8]27属69种1.7×
106 ind./L 87 mg/L35属104种1.7×
106 ind./L
2048 mg/L12属27种
3410 ind./L
68 mg/L5属6种7.7×
104 ind./L
249 mg/L淮河干流上游水质为轻污染,
中下游为中污染或重污染2011年3月—
2012年2月阜阳城
区[34]23属30种4138—7856 ind./L
0.15—0.35 mg/L23属58种1061—3356 ind./L
1.26—3.87 mg/L15属34种56—136 ind./L
0.9—1.7 mg/L6属12种12—
84 ind./L
1.56—
10.92 mg/L阜阳城区各水体均处于富营养
状态, 部分位点为重污染2011年4月—
2012年1月沙颍河阜
阳段[14]N N 7属11种 8属9种 浮游甲壳动物密度春季最高为
51.8 ind./L, 冬季最低为4.5 ind./L,
水体为轻度-中度污染2012年6月—
2013年8月淮河流域
信阳段[35]4属5种 8属17种 6属9种 3属5种 轮虫、枝角类和桡足类种类和数
量较多, 并且枝角类和桡足类生
物量也较大2012年12月—
2013年7月淮河中
上游[36]N 19属46种
3.3—391.2 ind./LN N 水质从冬季到夏季有恶化趋势,
营养化程度有增加的趋势
水体为轻度-中度富营养2013年8月—
2014年1月沙颍河
流域[37]N 85种 9种 7种 轮虫密度明显高于甲壳类浮游
动物的密度2014年冬季 淮河淮
南段[38]22种 6种 3种 7种 浮游动物密度为1313.17 ind./L,
生物量为0.23 mg/L, 水体为
中度污染注: N表示无数据 Note: N means no data 3. 讨论
3.1 沙颍河流域浮游动物群落结构变化特征
近年来国内外越来越多的学者关注于利用浮游动物评价水体生态系统是否健康[26, 27], 这是由于浮游动物个体小, 具有较短的世代交替周期, 对环境变化反应迅速。随着水体富营养化程度提高, 浮游动物群落结构趋于简单, 种类变少, 丰度增加, 多样性指数下降, 群落的稳定性降低[28]。因此, 浮游动物群落结构变化也成为了水生态系统中调查的热点。例如甬江干流[29]调查报道了轮虫24属72种, 枝角类5属20种, 桡足类11属13种, 湘江干流[30]报道了轮虫23属45种, 枝角类9属17种, 桡足类3属5种, 并利用浮游动物对水质进行了评价, 这些均说明浮游动物研究在水生态系统监测方面具有重要意义。
通过对比分析淮河流域浮游动物的历年调查研究发现(表 3), 淮河流域浮游动物研究主要集中在蚌埠、信阳、阜阳、淮河中上游沙颍河流域及干流, 浮游动物的种类数以小型浮游动物为主。此次, 沙颍河流域的20个采样点调查检测到浮游动物36属78种(不包括原生动物), 其中轮虫20属60种, 枝角类10属12种, 桡足类6属6种, 表明沙颍河流域浮游动物主要以轮虫为主。国内关于河流流域浮游动物调查结果也均显示浮游动物以小型浮游动物为主[8, 33, 39]。吴利等[8]2011年对淮河干流调查发现轮虫194种, 枝角类27种, 桡足类6种。左其亭等[28]2012年对淮河中上游轮虫群落结构的调查发现轮虫有46种。Zhao等[37]2013年对沙颍河流域调查发现轮虫85种, 枝角类9种, 桡足类7种。这与此次2016年沙颍河调查结果相比, 轮虫种类数有所下降, 枝角类种类数有所增加, 桡足类种类数没有太大变化。
3.2 沙颍河流域浮游动物密度和生物量空间变化特征
2011年淮河干流[8]轮虫密度高达1.7×106 ind./L, 生物量为2048 mg/L, 枝角类密度为3410 ind./L, 生物量为68 mg/L, 桡足类密度为7.7×104 ind./L, 生物量为249 mg/L; 同年, 沙颍河流域下游的阜阳城区[34]轮虫密度为1061—3356 ind./L, 生物量为1.26—3.87 mg/L, 枝角类密度为56—136 ind./L, 生物量为0.90—1.70 mg/L, 桡足类密度为12—84 ind./L, 生物量为1.56—10.92 mg/L。本研究各采样点浮游动物密度为125—13701 ind./L, 浮游动物的总生物量范围为0.15—9.32 mg/L。与2011年淮河干流浮游动物的调查结果相比较, 沙颍河流域浮游动物的密度和生物量相对偏低, 但与国内其他河流流域[29, 30]相比较而言, 此次沙颍河流域浮游动物的密度和生物量相对较高。有研究表明[40]轮虫喜欢富营养环境, 水体营养状态的提升有利于轮虫种类密度的提高, 枝角类喜还原性的中营养或贫营养的清洁水体, 枝角类对环境的响应能力更为敏感, 而桡足类受环境因子的影响较少。沙颍河流域结果显示浮游动物密度主要是由轮虫占大多数比例, 浮游甲壳类密度所占比例较低。同时, 通过表 3可明显发现该流域水体富营养污染严重, 这可能就是导致浮游动物密度较高的原因。此外, 浮游动物密度和生物量峰值出现在贾鲁河和双洎河流域, 地理位置处于沙颍河流域的上游, 从整体上而言, 随着水流汇入淮河过程中浮游动物的密度和生物量空间变化趋势相一致, 呈大致下降趋势。
3.3 沙颍河流域浮游动物对水质的总体评价
在本研究中, 沙颍河流域各采样点浮游动物优势种为1—7种, 常见优势种为长肢多肢轮虫、裂痕龟纹轮虫、角突臂尾轮虫、象鼻溞和微型裸腹溞, 沙颍河上游浮游动物优势种还分布有萼花臂尾轮虫和圆形盘肠溞等富营养化指示种, 中下游分布出现曲腿龟甲轮虫等喜清洁环境的指示种[22, 41]。沙颍河流域大多数优势种为喜富营养化水体的种类。综合分析各采样点的种群反映出沙颍河流域上游水体富营养化较为严重, 中下游水体富营养化有所缓解。
Shannon-Wiener多样性指数(H′)是用来反映生物群落结构的复杂性和稳定性, 表示群落物种内部及物种间分配均匀性的整体性指标, 在一定程度上可以指示水体环境。同时, Pielou指数(J′)描述群落中各种间个体分布均匀程度。沙颍河流域采样位点Shannon-Wiener多样性指数H′为1.03—3.51, Pielou指数J′的变化范围为0.26—0.70。参照水生生物评价水质的标准沙颍河流域水质总体呈现出中污染-重污染。
自1982年以来, 淮河流域浮游动物变化详见表 3, 淮河蚌埠段浮游动物变化明显, 耐污性浮游动物种类数降低, 水体质量变差[31, 32]; 淮南段[38]和信阳段[35]水体为轻污染-中污染; 淮河上游流域水体处于轻污染状态, 中下游水体为中-重污染状态[8, 33, 36]。此外, 有研究表明整个沙颍河流域属颍河周口段及其支流贾鲁河的重金属污染问题突出[42], 这说明水体污染状况很严重。此次调查结果显示贾鲁河上游(即1至3号采样点)水体为中-重污染, 贾鲁河下游(即4至5号采样点)水体为轻污染或无污染, 周口段水体为中污染, 表明周口段及贾鲁河水体污染问题依然需要严峻对待和治理。2011年沙颍河流域阜阳段[14]调查研究浮游甲壳动物发现水体为轻度-中度污染, 但阜阳城区[34]水体均处于富营养状态, 城区部分位点为重污染。历经5年之后, 本研究利用浮游动物评价水体状况, 发现阜阳段水体为中污染状态, 阜阳的水体污染状况依旧需要认真对待。据统计[43], 在我国的大多数河流中, 上游生物多样性指数较高, 下游多样性降低, 但是沙颍河流域却是上游个别采样点多样性指数低, 下游多样性指数相对较高。这可能是因为沙颍河上游城市人口聚集及生活污水排放导致水质污染严重, 多样性指数低; 下游人口稀少, 人为影响较少, 故水体状况相对良好。
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图版Ⅰ 自然发病濒死中华鳖症状
瑞氏-姬姆萨染色40×; 1. 后期病鳖的抬头; 2.健康中华鳖; 3. 病鳖腮腺充血; 4. 健康中华鳖腮腺; 5. 脾肿大、暗紫色; 6. 健康中华鳖脾脏; 7. 病鳖肠道痉挛/充血; 8. 健康中华鳖肠道; 9. 血涂片; 10. 肝涂片
图版Ⅰ. Gross signs of naturally infected Chinese soft-shelled turtles
Wright-Giemsa stain 40×; 1. craned and twisted necks; 2. heath Chinese soft-shelled turtles; 3. hemorrhagic parotid gland; 4. heath Chinese soft-shelled turtles parotid gland; 5. swollen spleen with dark purple; 6. heath Chinese soft-shelled turtles spleen; 7. spasm hemorrhagic intestina; 8. heath Chinese soft-shelled turtles intestina; 9. blood smear: 10. liver smear
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图 1 蜡样芽孢杆菌分离株T91-1
A. 在营养琼脂上的形态特征; B. 芽孢染色; C. 超薄切片: × 30000
Figure 1. B. cereus T91-1
A. B. cereus T91-1 was grown in nutrient agar plate and observed morphology character; B. B. cereus T91-1 of spore staining; C. B. cereus T91-1 of thin-layer electron microscopy: × 30000
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图 2 蜡样芽孢杆菌分离株T91-1的16S rDNA序列邻接法构建系统发育树
Figure 2. Phylogenetic tree constructed from 16S rDNA sequence analysis by Neighbor-Joining method
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图 3 蜡样芽孢杆菌分离株T91-1的gyrB序列邻接法构建系统发育树
Figure 3. Phylogenetic tree constructed from gyrB sequence analysis by Neighbor-Joining method
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图 4 T91-1口灌感染乳鼠的皮下出血症状
Figure 4. Subcutaneous hemorrhagic symptoms of moribund sucking mice oral infected by B. cereus T91-1
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图版Ⅱ 中华鳖组织病理特征
HE染色 400×; 1. 肾小管上皮细胞肿大、颗粒变性(箭头a), 肾小管间界限消失, 形成合包体(箭头c), 肾小管间小血管扩张(箭头b); 2. 肾小球萎缩, 结构崩解, 肾小囊腔变大, 囊壁上皮细胞溶解坏死(箭头a), 大量芽孢样杆菌(箭头b); 3. 健康中华鳖肾组织; 4. 肝细胞颗粒变性(箭头a), 肝组织血管扩张充血(箭头b), 肝细胞间界限模糊(箭头c), 肝组织中炎症细胞浸润(箭头d); 5. 肝组织大量芽孢样杆菌(箭头a)、血铁黄素沉着(箭头b)(HE, 400×); 6. 健康中华鳖肝组织; 7 . 肺组织中出现血铁黄素沉着(箭头a), 大量短杆状芽孢杆菌(箭头b); 8. 肺组织血管扩张严重充血(箭头a), 肺组织中嗜酸性粒细胞浸润(箭头b); 9. 健康中华鳖肺组织; 10. 自然发病中华鳖心组织血管扩张充血(箭头a)和芽孢样杆菌(箭头b); 11. 自然发病中华鳖心组织嗜酸性粒细胞浸润; 12. 健康中华鳖心组织
图版Ⅱ. Histopathological characteristics in Chinese soft-shelled turtle
HE staining 400×, 1. swellen renal tubular epithelial cells with flocular degeneration (arrow a), renal tubular interstitial boundaries indistincted and symplast formed (arrow c) in naturally infected soft-shelled turtle; 2. atrophy glomerular, and enlarged renal capsular space with necrosis epithelial cells of renal capsule wall (arrow a) and Bacillus-like bacteria (arrow b) in naturally infected soft-shelled turtle; 3. health Chinese soft-shelled turtle kidney tissue; 4. flocular degeneration (arrow a), vascular dilated and congested (arrow b), indistinct boundaries in hepatocytes (arrow c), inflammatory cells infiltration in liver (arrow d) in naturally infected soft-shelled turtle; 5. large number of Bacillus-like bacteria (arrow a) with hemosiderosis (arrow b) in naturally infected soft-shelled turtle; 6. health Chinese soft-shelled turtle liver tissue; 7. hemosiderosis lung (arrow a), large number of Bacillus-like bacteria (arrow b) in naturally infected soft-shelled turtle; 8. congested pulmonary artery (arrow a) with infiltrated eosinophils (arrow b) in naturally infected soft-shelled turtle; 9. health Chinese soft-shelled turtle lung tissue; 10. Vascular dilatation and hyperemiacongestion (arrow a) and Baclillus-like bacteria (arrow b) innaturally infected soft-shelled turtle; 11. eosinophils infiltrated in heart in naturally infected soft-shelled turtle; 12. health chinese soft-shelled turtle heart tissue
表 1 API 50 CHB生化鉴定结果
Table 1 The result of API 50 CHB
生化性状
Biochem testT91-1 ATCC
14579生化性状
Biochem testT91-1 ATCC
14579生化性状
Biochem testT91-1 ATCC
14579对照Control − − 肌醇INO − − D-棉子糖RAF − − 甘露醇GLY + ND 甘露醇MAN − − 淀粉AMD + + 赤藻糖醇ERY − − 山梨醇SOB − − 糖原GLYG + + D-阿拉伯糖DARA − − L-山梨糖SBE − − 木糖醇XLT − − L-阿拉伯糖LARA − − L-鼠李糖RHA − d D-龙胆二糖GEN − d D-核糖RIB + + 卫茅醇DUL − − D-土伦糖TUR − d D-木糖DXYL − − 苦杏仁苷AMY − − D-来苏糖LYX − − L-木糖LXYL − − 熊果甙ARB + + D-塔格糖TAG − − D-侧金盏花醇1 ADO − − 水杨苷SAL + + D-岩藻糖DFUC − − 甲基-β-D-吡喃木糖苷MDX − − D-纤维二糖CEL + d L-岩藻糖LFUC − − 甲基-α-D-吡喃甘露糖苷MDM − − D-麦芽糖MAL + + D-阿拉伯醇DARL − − 甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷MDG − D-乳糖LAC − − L-阿拉伯醇LARL − − N-乙酰葡萄糖胺NAG + + D-蜜二糖MEL − − D-半乳糖GAL − − 七叶灵柠檬酸铁ESC + + D-蔗糖SAC − d D-葡萄糖GLU + + 葡萄糖酸钾GNT + ND D-海藻糖TRE + + D-果糖FRU + + 2 酮基葡萄糖酸钾2KG − − 菊粉INU − − D-甘露糖MNE − − 5酮基葡萄糖酸钾5KG − − D-松三糖MLZ − − 注: 阳性. +; 阴性. −; ND. 文献中该性状数据; d−. 存在不同性状Note: positive. +; negative. −; ND. characterin reference; d−. different 
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